通常肿瘤细胞通过下调MHC-I分子的表达（missing-self）逃避CD8+ T细胞的检测。但，MHC-I非依赖性的NK细胞可以识别并对“missing-self”表型的细胞产生应答，最终导致靶细胞的裂解。因此，NK细胞能够弥补CD8+ T细胞在这些情况下的免疫监视的不足，成为对抗异常细胞的一个重要组成部分。

此外，不同于其他免疫细胞，NK细胞的激活不需要特定的抗原，它们可以通过白细胞介素-2（IL-2）或IL-15启动。这使得NK细胞成为细胞治疗的有吸引力的选择。

02 NK细胞生物学

NK细胞的发育

NK细胞源自骨髓中的造血干细胞， IL-15与 NK细胞前体的受体结合后促进其发育成NK细胞。NK细胞在发育过程中受到多种转录因子的调控，其中E4BP4、TBX21、EOMES、GATA3和ID2等起着重要作用。

NK细胞的发育过程

NK细胞起源于骨髓中的造血干细胞和淋巴样祖细胞。未成熟的NK细胞表达CD122和NCR，如NKp46、NKp30和NKp44。包括CXCR3、CX3CR1和S1P5R在内的趋化受体参与了NK细胞的迁移。在血液中，主要存在两种类型的NK细胞，即CD56bright和CD56dim，其中CD56dim NK细胞表达CD16。长寿NK细胞表达CD57。组织驻留的NK细胞表达CD49a、CD103、CD69和CD56。

NK细胞的受体和功能

NK细胞通过激活型受体（如，NKG2D）和自然细胞毒性受体（NCR，如NKp30、NKp44、NKp46）识别missing self的靶细胞（如感染病毒、肿瘤细胞或处于衰老状态的细胞）。NK细胞通过激活受体激活信号通路（如ITAM或YINM），释放perforin和granzyme等物质诱导靶细胞凋亡。此外，外周血中的CD56dim NK细胞可通过CD16介导的ADCC效应杀伤靶细胞。

抑制性受体（如KIR家族和CD94/NKG2A异二聚体）识别MHC-I分子，调节NK细胞活性。

NK细胞表达趋化因子和各种不同的受体，如，CD56bright NK细胞表达与骨髓或淋巴结定居相关的趋化受体，而CD56dim NK细胞表达CX3CR1、ChemR23或CXCR1。NK细胞通过受体和趋化因子的多样性调控其识别和攻击靶细胞的能力。

NK细胞活化过程中的信号转导

NK细胞的激活信号转导途径

在识别配体后，NK细胞表面的激活受体通过适配蛋白DAP10和DAP12启动细胞内信号传导。这些信号通路刺激与细胞因子和细胞毒性相关的基因转录，发挥NK细胞监视的关键功能。

NK细胞激活的信号传导路径包括多个重要的通路。激活NK细胞受体后，适配蛋白DAP10和DAP12的磷酸化启动下游信号传导。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的激活通过招募AKT蛋白，促进细胞存活和代谢。MAPK通路也被激活，引发一系列磷酸化事件，最终导致基因转录和细胞因子分泌。

PLCγ2引发内质网中钙离子的释放并激活PKC，造成NFAT去磷酸化。去磷酸化的NFAT迁移到细胞核，促进与NK细胞细胞毒性和细胞因子产生相关的基因转录。

在免疫抑制性的肿瘤微环境中，TGF-β1通过mTOR通路抑制IL-15促进的NK细胞活化。

老年人的NK细胞

随着年龄增长，NK细胞的数量通常保持稳定甚至增加，但是老年人的NK细胞功能性枯竭更为显著，NK细胞的功能下降可能与老年人肿瘤和其他疾病风险上升有关。

03 能用NK细胞疗法治疗的疾病

NK细胞治疗比CAR-T细胞疗法更安全，NK细胞治疗可以减少细胞因子释放综合征（CRS）或神经毒性的发生，并且成本更低。

血液系统恶性肿瘤

血液系统恶性肿瘤中，因为肿瘤细胞表达较为单一的抗原，且免疫细胞能够有效地到达血液造血器官中的肿瘤部位，因此免疫细胞治疗非常有效。

脐带血来源的CD19 CAR NK细胞的 I/II期临床试验显示：治疗反应率达73%，回输的CAR-NK细胞长期存活且没有产生细胞因子释放综合征（CRS）毒性。CAR-NK细胞即使CAR丢失也能维持治疗效果。临床前研究也显示了，靶向CD5和CD7等抗原的CAR-NK细胞具有有效性。

实体瘤

原发性实体瘤

外周血中NK细胞数量与实体肿瘤如非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤和结直肠癌等预后相关。然而，实体肿瘤微环境常使NK细胞功能受损，导致NK细胞数量和功能显著降低。实体肿瘤中NK细胞的细胞因子水平（如IFN-γ和TNF-α）通常较低。

乳腺癌或胰腺癌样本中的NK细胞抑制性受体表达增加，激活性受体水平降低。此外，NKp30的配体可溶性B7-H6与NK细胞中NKp30表达的降低相关联，可能加剧NK细胞的抑制。类似T细胞的衰竭标志物PD-1、TIM3和TIGIT也存在于肿瘤患者的NK细胞中，表明NK细胞有与T细胞相似的衰竭表型。

转移性肿瘤

NK细胞对于控制肿瘤的转移和扩散具有重要作用。一方面，NK细胞可以通过消除血液循环中或其他器官内的肿瘤细胞抑制转移。另一方面，肿瘤细胞够改变NK细胞的活性，通过重编程NK细胞，降低其对肿瘤细胞的杀伤作用，进而促进转移的发生。

多克隆和单克隆肿瘤细胞簇对NK细胞反应不同，多克隆簇对NK细胞具有抵抗性。

转移的肿瘤细胞还可能进入休眠状态，暂时逃避免疫系统的监视。但当这些休眠细胞重新活跃，开始分裂时，它们可能变得更易受到NK细胞的杀伤。

扩大NK细胞治疗的范围

NK细胞疗法也在与年龄相关的疾病中进行探索。细胞衰老是衰老的标志，对于肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染都有复杂的影响。

细胞衰老相关疾病

NK细胞具有识别和清除衰老细胞的能力，采用针对特定受体或使用针对衰老细胞的CAR-NK策略为对抗与衰老相关的疾病提供了希望。

自身免疫疾病和病毒感染

NK细胞在直接清除病毒感染细胞和刺激抗病毒免疫反应方面发挥着关键作用。NK细胞数量与病毒感染的严重程度和复发率呈负相关。慢性病毒感染可能加剧肿瘤进展和自身免疫性疾病，并且NK细胞功能障碍与这些病毒所介导的疾病的发病机制有关。

04 用于过继性细胞疗法的NK细胞基因工程

通过基因工程技术对NK细胞进行改造已成为下一代治疗方法。

用于免疫细胞移植的NK细胞来源

目前，对于NK细胞的来源，已有多种途径，包括外周血单个核细胞（PBMC）、脐带血、NK-92细胞和诱导多能干细胞（iPSCs）。

NK-92细胞来源于NK淋巴瘤，作为研究工具在CAR和细胞基因改造方面具有价值，但由于缺乏CD16并且需要在输注给患者前进行照射，其效果可能受到限制。

从脐带血或外周血获得的原代NK细胞不仅包含细胞毒性NK细胞，还含有CD34+造血干细胞，可以扩增并分化成成熟的NK细胞。这两种来源的NK细胞在进行CAR基因转导后对白血病都表现出不错的治疗效果。但是，脐带血来源的NK细胞表现出比外周血来源更高的增殖能力。

iPSC来源的NK细胞具有均一的特性，并且容易扩增。iPSC可以经基因修饰表达或去除特定基因，随后进行治疗性NK细胞分化。然而，由于存在未分化的iPSC和分化方案的复杂性，安全性方面仍存在一些问题。

增强靶细胞的识别

为了增强NK细胞的功能，目前的策略集中在提高细胞对靶细胞的识别、增强NK细胞的持久性以及提高其在肿瘤内的浸润能力。

2020年关于针对CD19的CAR-NK细胞在血液瘤治疗中取得了进展。目前全球正在进行至少30项不同来源NK细胞的CAR-NK细胞的临床试验用于治疗包括血液恶性肿瘤、实体瘤以及COVID-19在内的不同疾病。

尽管第二代CAR能够刺激NK细胞（例如T细胞），但研究人员一直在探索可用于NK细胞激活的新型细胞内CAR结构域。如DAP10和DAP12可以与激活型NK细胞受体相关联，招募PI3K；其现已成为CD3z在CAR-NK细胞中的潜在替代物。此外，针对肿瘤细胞中NKG2D配体的NKG2D工程CAR（NKG2D-DAP10-CD3z）-NK细胞也已在试验中。

利用iPSC来源的NK细胞进行CAR构建试验显示NKG2D是iPSC-NK细胞中具有较好活性的跨膜域。类似地，在anti-GPC3 CAR-NK-92细胞中，表达DNAM1的效果比CD28更好。

提高NK细胞的持久性

在人外周血来源的NK细胞中表达膜结合形式的IL-15可以提高NK细胞的存活和体内抗肿瘤活性。在CB来源的NK细胞中转入CD19 CAR、IL-15和可诱导的Caspase-9自杀基因可延长NK细胞的存活期。抗BCMA CAR、非剪切CD16a Fc受体和膜结合IL-15/IL-15R融合分子四基因修饰的iPSC来源的NK细胞可以靶向表达BCMA的肿瘤细胞，并具有更好的ADCC效应和体内持久性。

此外，CRISPR-Cas9基因编辑已用于删除NK细胞中的负调控因子（CIS、TIPE2等），以提高NK细胞的抗肿瘤活性。

增加NK细胞对实体瘤的浸润和NK细胞的活性

针对实体瘤， NKG2A基因失活已用于调节NK细胞中的抑制信号，并在小鼠模型中显示出其优越的效应。在肿瘤微环境中，通过删除CAR-NK细胞的腺苷A2A受体来消除腺苷的免疫抑制作用。

CD38不仅表达于多发性骨髓瘤细胞也表达于NK细胞上，治疗性单抗daratumumab靶向CD38会导致NK细胞灭活，NK细胞CRISPR 敲除CD38后显示出了治疗效果改善。

由于肿瘤微环境的免疫抑制性，在NK细胞中过表达趋化因子受体（如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CCR7和CXCR4），提高NK细胞针对实体瘤的靶向性已在试验中。过表达高亲和力显性抑制TGF-β受体（TGF-β DNRII）也已用于抑制TGF-β信号。

此外，通过病毒转导靶向NK细胞上的抑制性受体，如，在人PB-NK中表达NKG2A蛋白表达阻断剂（PEBL）能消除NKG2A的表达，也可以增强了NK细胞的细胞毒性和体内抗肿瘤活性。

05 控制NK细胞激活的疗法

针对NK细胞的激活和功能增强的治疗方法可以作为单一疗法，也可以与其他策略结合使用。

抗体

对ADCC响应的抗体

NK细胞的CD16能识别结合有IgG1或IgG3的细胞，并通过ADCC效应杀伤目标细胞。CD16 158F变体与抗体Fc区域的亲和力较低，因此，患者对抗体的反应有限（158V（缬氨酸）变体更高的抗体亲和力）。为了克服这个问题，诱导ADCC的单克隆抗体的开发集中在提高低亲和力变体的亲和力上。Elotuzumab、Margetuximab等抗体都已提高了与地亲和力CD16的结合能力并诱导了强有力的ADCC效应。

NK细胞结合物

双特异性和三特异性杀伤结合物（BiKEs和TriKEs）的使用与诱导ADCC的抗体类似，这些分子促进了效应细胞和靶细胞之间的相互作用，通过CD16激活NK细胞。与抗体不同的是，BiKEs和TriKEs仅通过Fv片段靶向CD16，从而减少了脱靶效应。

免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂（ICI，如抗PD1、PD-L1和CTLA4）抗体在刺激免疫系统清除肿瘤已经成功。其主要作用机制是防止T细胞耗竭，但有迹象表明NK细胞也可能受益。

肿瘤细胞表面的PD-L1所诱导的ADCC效应与ICIs结合可能产生协同的抗肿瘤效果。LAG3、TIM3和TIGIT等受体也表达于肿瘤浸润NK细胞，研究表明，TIGIT抗体可以增强NK介导的抗肿瘤反应。此外，NK细胞特异性的免疫检查点抑制剂也在研发中。

lirilumab是一种KIR抗体，用于靶向HLA-C特异性的KIR2D受体家族，但是单独使用临床效果并不显著。另一个潜在的NK特异性免疫检查点抑制剂靶点是NKG2A，其抗体Monalizumab正在临床试验中。

其他NK细胞激活剂和应用策略

除了抗体和结合物外，增强NK细胞对肿瘤细胞活性的多种较多。药物干预和细胞因子是主要策略。如，免疫调节咪唑类药物（IMiDs）如来那度胺和泼马度胺可激活NK细胞，提高其杀伤能力。其他药物如硼替佐米和BH3类拟激素也能增加肿瘤细胞对NK细胞的敏感性。

抑制肿瘤微环境对NK细胞的抑制作用可提高NK细胞对肿瘤的活性。靶向TGF-β信号通路的药物能增强NK细胞介导的抗肿瘤活性。另外，STING激活剂能激活NK细胞，目前正在临床试验。此外，如IL-2、IL-15、IL-12等也可刺激NK细胞增殖和活性。

利用NK细胞进行治疗的方法总结

NK细胞移植已显示其在治疗肿瘤方面的功效，其他策略也在进一步改善其功能。如，通过CRISPR-Cas系统进行基因组编辑引入CAR、趋化受体和其他修饰。此外，ADCC可以有效诱导NK细胞的杀伤活性。单克隆抗体、BiKEs和TriKEs等诱导ADCC的治疗方法正在进行临床试验中。增强细胞活性的TME抑制剂和细胞因子也在开发中，并且正在探索这些药物与NK细胞或其他治疗方法的联合应用。此外，NK细胞治疗在病毒感染和衰老等方面的应用也在开发中。

06 结论

NK细胞的治疗已显示出巨大潜力，但通过了解NK细胞特异性机制来优化组合治疗方法可能进一步提高其疗效。

BPS Bioscience的NK细胞研究解决方案

编译自

1. Shin E, Bak SH, Park T, Kim JW, Yoon S-R, Jung H and Noh J-Y (2023) Understanding NK cell biology for harnessing NK cell therapies: targeting cancer and beyond. Front. Immunol. 14:1192907.

01 背景